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    中華人民共和國國家標準
    　　　　　　　　GB xxxx--xxxx
    　雙孢蘑菇菌種
    Spawn of Agaricus bisporus (報批稿)
    200x-xx-xx發布 200x-xx-xx實施
    --------------------------------------------------------
    國家技術監督局　　發 布
    前　　　言
    栽培雙孢蘑菇使用的菌種是人工培育的純菌絲體及其培養基的混合體。我國采用三級擴大繁育程序（即母種、原種、栽培種）培育雙孢蘑菇菌種。
    為了規范我國雙孢蘑菇菌種生產、經銷和使用，確保我國雙孢蘑菇生產持續健康發展，特制訂本標準。
    本標準由中華人民共和國農業部提出并歸口。
    本標準起草單位：福建省輕工業研究所、福建省蘑菇菌種研究推廣站。
    本標準主要起草人：王澤生、廖劍華、曾輝、陳軍、陳美元
    1 范圍
    本標準規定了雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）菌種的質量要求、試驗方法、檢驗規則及標簽、標志、包裝、貯運等。
    本標準適用于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）的生產、流通和使用。
    2 引用標準
    下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。在本標準出版時，所示版本均為有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。
    GB191－1990 包裝儲運圖示標準　
    GB4789.28－1994　食品衛生微生物學檢驗　染色法、培養基和試劑
    GB9687－1988 食品包裝用聚乙烯成型品衛生標準
    GB9688－1988 食品包裝用聚丙烯成型品衛生標準
    GB/T12728－1991　食用菌術語
   
    3 定義
    本標準采用下列定義。
    3.1 母種　stock culture
    經各種方法分離、選育或雜交得到的具有出菇能力的菌絲體純培養物及其繼代培養物。
    3.2 原種 pre-culture spawn
    由母種移植、擴大培養而成的菌絲體純培養物。
    栽培種 spawn
    由原種移植、擴大培養而成的菌絲體純培養物。
    3.4 拮抗現象 antagonism
    具有不同遺傳基因的菌落間產生不生長區帶或形成不同形式線形邊緣的現象。
    3.5 無棉塑料蓋 plastic stop
    可代替塑料蓋，帶有某種高分子或纖維材料可滿足濾菌和透氣要求的塑料蓋。
    3.6 玻璃菌種瓶 glass spawn bottle
    圓柱形，容積750mL，耐126℃高溫，無色、淡綠色或淡蘭色的透明玻璃瓶。瓶體總高190mm±2mm，瓶頸高25mm±1mm，瓶口外徑40mm±1mm，瓶體外徑82mm±1mm。
    3.7 塑料菌種瓶 polypropylene spawn bottle
    圓柱形，容積850mL，耐126℃高溫，白色、半透明，衛生標準符合GB9688規定的塑料瓶。瓶體總高165mm±2mm，瓶頸高28mm±1mm，瓶口外徑63mm±1mm，瓶體外徑90mm±1mm。
    3.8 角變 sector
    　　因菌絲體局部變異或感染病毒而導致菌絲變細、生長緩慢、菌絲體表面特征成角狀異常的現象。
    3.9 高溫抑制線 high temperatured line
    食用菌菌種在生長過程中受高溫的不良影響，培養物出現的圈狀發黃、發暗或菌絲變稀弱的現象。
    3.10 同工酶 isoenzyme
    催化相同生化反應，而結構及理化性質不同的酶分子。通過凝膠電泳使同工酶分離成遷移率不同的區帶，經生物化學染色后顯示出的同工酶譜，可對生物品種進行酶分子水平的鑒別或鑒定。
    4 質量要求
    4.1母種
    4.1.1　容器規格 采用18 mmX180mm、20mm X200mm的玻璃試管。
    4.1.2　培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基），按GB4789.28中4.79規定配置?！　?/span>
    4.1.3感官指標 符合表1規定。
    表1
    項目要求
    棉塞或無棉塑料蓋干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
    培養基灌入量 為試管總體積的十分之一至五分之一
    培養基斜面長度為試管總長度的二分之一至五分之一
    斜面接種塊大小 3~5mmX3~5mm
   
    培養基斜面 正面外觀
    菌絲體特征 潔白或米白、濃密、羽毛狀或葉脈狀
    菌絲體表面 均勻、平整、無角變
    菌絲分泌物 無
    菌落邊緣整齊，無膏狀、蠟狀細菌或酵母菌菌落及霉菌菌落
    培養基斜面背面外觀 培養基不干縮，顏色均勻、無暗斑、無色素
    培養物氣味有雙孢蘑菇菌種特有的香味，無酸、臭、霉等異味
    培養物鏡檢 菌絲粗壯，無雜菌菌絲及孢子，無蟲及蟲卵。
    4.1.4　菌絲生長速度 在適溫（24℃±1℃）下，15－20天長滿試管。
    4.1.5 母種遺傳和栽培性狀 供種單位，母種需經酯酶(Est)同工酶類型鑒定，確認其遺傳類型與對照相
    同后，需再經出菇試驗確定產量及品質等栽培農藝性狀合格后，方可用于擴大繁殖或出售。
    4.1.5.1菌絲體Est同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳類型 包括G型(呈現e1,e3特征帶)、H型(呈現e2,e4和e30-33特征帶)、HG1~HG2型(呈現e1,e3,e30-33特征帶)和HG4型(呈現e1,2,3,4和e30-33特征帶)等。以Est區帶向正極泳動距離與溴酚藍指示劑向正極泳動距離的比值作為電泳相對遷移率(Rm)。e1,e2,e3,e4,e30,e31,e32和e33的Rm值分別為0.820,0.810,0.760,0.750,0.128,0.100,0.070和0.010。
    4.1.5.2 菌絲萌發、定植能力 接種到適合的培養基后，在正常條件下24小時內萌發恢復，定植迅速、菌
    絲健壯，20天以內長滿培養基。
    4.1.5.3 結菇轉潮能力 覆土后12～16天結菇，分布均勻；18～22天采菇，每潮菇間隔7～10天。
    4.1.5.4 抗逆性 對溫度、濕度、酸堿度等生長條件變化耐受能力較強；對主要病蟲害的抵抗能力較強。
    4.1.5.5 生物學效率 在正常條件下生物學效率不低于30%。
    4.2　原種
    4.2.1　容器規格 玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶，分別符合3.6和3.7規定。
    4.2.2　培養基
    4.2.2.1　腐熟麥桿或稻桿(干)77%，腐熟牛糞粉(干)20%,石膏粉1%,碳酸鈣2%,含水量62%±1%,pH7.5。
    4.2.2.2 腐熟棉籽殼（干）97%，石膏粉1%, 碳酸鈣2%, 含水量55%±1%, pH7.5。
    4.2.3　感官指標 符合表2規定。
    表2
    項目 要求
    棉塞或無棉塑料蓋 干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
    培養基上表面距瓶口的距離 50 mm±5mm
    接種量 每支母種接原種 4－6瓶
    菌種瓶外觀
    菌絲體特征 潔白濃密、生長旺健
    培養物表面菌絲體生長均勻，無角變，無高溫抑制線
    培養基及菌絲體緊貼瓶壁，無干縮
    培養物表面分泌物 無
    各種雜菌孢子、菌絲 無
    拮抗現象 無
    培養物氣味 有蘑菇菌種特有的香味，無酸、臭、霉等異味
    培養物鏡檢 菌絲粗壯、無雜菌菌絲和孢子、無蟲及蟲卵
    4.2.4菌絲生長速度：原種瓶應發滿菌絲，在適溫（24℃±1℃）下菌絲長滿瓶不超過45天。
    4.3 栽培種
    4.3.1　容器規格： 玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶，也可采用不小于15cm×28cm，厚0.04mm-0.06mm的聚丙烯塑料袋。塑料袋的衛生標準符合GB9687和GB9688規定。
    4.3.2　培養基 除同4.2.2.1和4.2.2.2外，另可用以下兩種。
    4.3.2.1 谷粒98%，石膏粉2%, 含水量50%±1%, pH7.5～8.0。
    4.3.2.2 其它經省級或省級以上鑒定適合于雙孢蘑菇菌絲生長的培養基。
    4.3.3感官指標 符合表3規定。
    表3
    項目要求
    棉塞或無棉塑料蓋 干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
    培養基面距瓶（袋）口的距離 50 mm±5mm
    接種量 每瓶原種接栽培種 30－50瓶（袋）
    菌種瓶（袋） 外觀
    菌絲體特征 潔白濃密、生長旺健
    不同部位菌絲體 生長均勻，無角變，無高溫抑制線
    培養基及菌絲體 緊貼瓶（袋）壁，無干縮
    培養物表面分泌物 無
    各種雜菌孢子、菌絲 無
    拮抗現象 無
    培養物氣味 有蘑菇菌種特有的香味，無酸、臭、霉等異味
    培養物鏡檢 菌絲粗壯、無雜菌菌絲和孢子、無蟲及蟲卵
    4.3.4 菌絲生長速度 栽培種瓶（袋）應發滿菌絲，在適溫（24℃±1℃）下菌絲長滿菌種瓶（袋）不超過45天。
    4.3.5 種源 應使用通過省級或省級以上菌種審定委員會審定、認定或登記的品種，并從具有相應技術資質的供種單位引種。
    5 抽樣
    5.1質檢部門的抽樣應具有代表性。
    5.2母種按品種、培養條件、接種時間分批編號，原種、栽培種按菌種來源、制種方法和接種時間分批編號。按批隨機抽取被檢樣品。
    5.3母種、原種、栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%，5%，1%。但每批抽樣數量不得少于10支、瓶（袋）；超過100支、瓶（袋）的，可進行兩級抽樣。
    6 試驗方法
    6.1 感官檢驗
    6.1.3表1、表2、表3中除接種量、培養物氣味和培養物鏡檢三項外的各項，用肉眼或5X放大鏡觀察。
    6.1.4表1、表2、表3中培養物氣味，以鼻嗅判斷。
    6.1.5表1、表2、表3中培養物鏡檢，用放大倍數不低于10X40的光學顯微鏡對培養物的水封片進行觀察，每一檢樣應觀察不少于30個視野。
    6.1.6表2、表3中接種量，需察看菌種廠的生產紀錄。
    6.2細菌檢驗
    取少量疑有細菌污染的培養物，按無菌操作接入GB4789.28中4.8規定的營養肉湯培養液中，25℃-28℃振蕩培養1－2天，觀察培養液是否混濁。培養液混濁，為有細菌污染；培養液澄清，為無細菌污染。
    6.3母種遺傳和栽培性狀檢驗
    6.3.1 Est同工酶鑒定
    取菌齡為15-20天的試管母種, 刮取菌絲, 按1:3:0.5的比例混合菌絲(g)、0.1Mol/L磷酸緩沖液(mL)和石英砂(g), 研磨成勻漿, 臺式離心機10000r/min離心5min, 取上清液, 按5:1:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%溴酚藍溶液作為電泳樣品, 4℃下冷藏備用。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。用pH8.9Tris-HCl緩沖液配制9%分離膠,用pH8.3Tris-甘氨酸作電極緩沖液。點樣75uL, 3℃下120V電泳20min后穩壓200V, 4h。用固藍RR鹽60mg, 0.1Mol/L磷酸緩沖液(pH6.0) 80mL α-萘乙酯38mg和β-萘乙酯38mg溶于3mL丙酮配制的染色液染色,顯現酶譜,再根據特征帶分型。
    6.3.2 栽培性狀
    將被檢母種制成原種。采用4.2.2.1的培養基配方（含水量提高到68%），配制360千克培養基, 接種后分3組(每組2M2)進行常規管理，根據表4所列項目，做好栽培記錄，統計檢驗結果。同時將該母種的出發菌株設為對照，亦做同樣處理。對比二者的檢驗結果，以時間計的檢驗項目中，被檢母種的任何一項時間較對照菌株推遲5天以上（含5天）者，為不合格；產量性狀差異顯著低于對照菌株者，為不合格；菇體外觀形態與對照明顯不同或畸形者，為不合格。
    表4
   
    檢驗項目 檢驗結果 檢驗項目 檢驗結果
    母種發滿所需時間，天
    轉潮間隔時間，天
    原種發滿所需時間，天
    總產，Kg
    栽培種發滿所需時間，天
    平均單產，Kg
    菌種萌發所需時間，天
    平均單菇重，g
    菌絲發滿培養基所需時間，天
    生物學效率，%
    覆土至扭結所需時間，天
    菇型、色澤
    覆土至采菇所需時間，天
    菇蓋直徑、厚度、柄長、柄的直徑，mm
    6.4留樣
    各級菌種要留樣備查，留樣的數量應每個批號母種3-5支，原種和栽培種5-7瓶，于4℃-6℃下貯存，母種5個月，原種4個月，栽培種2個月。
    7 檢驗規則
    7.1判定規則按質量要求進行。檢驗項目全部符合質量要求時，為合格菌種，其中任何一項不符合要求，均為不合格菌種。
    8 標志、包裝、運輸、貯存
    8.1標志
    8.1.1產品標志 每支、瓶（袋）菌種要貼有清晰注明以下要素的標志。
    a. 產品名稱（雙孢蘑菇母種）
    b. 品種名稱（As2796）
    c. 生產單位（xxx菌種廠）
    d. 接種日期（2000.xx.xx）　　
    8.1.2包裝標志 每箱菌種要貼有清晰注明以下要素的包裝標志。
    a. 產品名稱、品種名稱
    b. 廠名、廠址、聯系電話
    c. 出廠日期
    d. 保質期、貯存條件、執行標準
    e. 發貨單位
    f.收貨單位
    g. 數量
    h. 毛重、凈重
    i. 執行標準
    8.1.3 包裝儲運圖示 按GB191規定，應注明以下圖示標志：
    a. 小心輕放標志
    b.防水防潮防凍標志
    c.防曬防高溫標志
    d.防止倒置標志
    e.防止重壓標志
    8.2 包裝
    8.2.1　母種外包裝采用木盒或有足夠強度的紙材制做的紙箱，內部用棉花、碎紙、報紙等具有緩沖作用的輕質材料填滿。
    8.2.2　原種、栽培種外包裝采用有足夠強度的紙材制做的紙箱，每箱20瓶，內部用碎紙、報紙等具有緩沖作用的輕質材料填滿。紙箱上部和底部用8cm寬的膠帶封口，并用打包帶捆扎兩道，箱內附產品合格證書和使用說明（包括菌種種性、培養基配方及適用范圍）。
    8.3　運輸
    8.3.1　不得與有毒物品混裝。
    8.3.2　氣溫達30℃以上時，需用2℃-20℃的冷藏車運輸。
    8.3.3　運輸中須有防震、防曬、防雨淋、防凍、防雜菌污染的措施。
    8.4 貯存
    8.4.1　母種一般在5℃±1℃冰箱中貯存，保藏期不超過90天。
    8.4.2　原種應盡快使用，10天內可在溫度24℃±1℃、清潔、通風、干燥(相對濕度70%-75%)、 避光的室內存放。在5℃±1℃下貯存，保藏期不超過40天。
    8.4.3 栽培種應盡快使用，在溫度24℃±1℃、清潔、通風、干燥(相對濕度70%-75%)、 避光的室內存放谷粒種不超過10天，其余培養基的栽培種不超過20天。在5℃±1℃下可貯存90天。