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GB  中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 
GB xxxx--xxxx
雙孢蘑菇菌種 
Spawn of Agaricus bisporus (報(bào)批稿) 
200x-xx-xx發(fā)布 200x-xx-xx實(shí)施
                           
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                            國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局　　發(fā) 布 
                            前　　　言 
    栽培雙孢蘑菇使用的菌種是人工培育的純菌絲體及其培養(yǎng)基的混合體。我國(guó)采用三級(jí)擴(kuò)大繁育程序（即母種、原種、栽培種）培育雙孢蘑菇菌種。為了規(guī)范我國(guó)雙孢蘑菇菌種生產(chǎn)、經(jīng)銷和使用，確保我國(guó)雙孢蘑菇生產(chǎn)持續(xù)健康發(fā)展，特制訂本標(biāo)準(zhǔn)。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出并歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省輕工業(yè)研究所、福建省蘑菇菌種研究推廣站。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王澤生、廖劍華、曾輝、陳軍、陳美元
1 范圍 
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了雙孢蘑菇（Agaricus  bisporus）菌種的質(zhì)量要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則及標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、貯運(yùn)等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）的生產(chǎn)、流通和使用。
2 引用標(biāo)準(zhǔn) 
下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。在本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。
GB191－1990 包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)準(zhǔn)　
GB4789.28－1994　食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)　染色法、培養(yǎng)基和試劑
GB9687－1988 食品包裝用聚乙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)
GB9688－1988 食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)
GB/T12728－1991　食用菌術(shù)語(yǔ)
3 定義 
本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。 
3.1 母種　stock culture
經(jīng)各種方法分離、選育或雜交得到的具有出菇能力的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物。 3.2 原種 pre-culture spawn 由母種移植、擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。
栽培種 spawn 由原種移植、擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。
3.4 拮抗現(xiàn)象 antagonism
具有不同遺傳基因的菌落間產(chǎn)生不生長(zhǎng)區(qū)帶或形成不同形式線形邊緣的現(xiàn)象。
3.5 無(wú)棉塑料蓋 plastic stop 
可代替塑料蓋，帶有某種高分子或纖維材料可滿足濾菌和透氣要求的塑料蓋。
3.6 玻璃菌種瓶 glass spawn bottle
圓柱形，容積750mL，耐126℃高溫，無(wú)色、淡綠色或淡蘭色的透明玻璃瓶。瓶體總高190mm±2mm，瓶頸高25mm±1mm，瓶口外徑40mm±1mm，瓶體外徑82mm±1mm。

3.7 塑料菌種瓶 polypropylene spawn bottle
圓柱形，容積850mL，耐126℃高溫，白色、半透明，衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)符合GB9688規(guī)定的塑料瓶。瓶體總高165mm±2mm，瓶頸高28mm±1mm，瓶口外徑63mm±1mm，瓶體外徑90mm±1mm。

3.8 角變 sector
因菌絲體局部變異或感染病毒而導(dǎo)致菌絲變細(xì)、生長(zhǎng)緩慢、菌絲體表面特征成角狀異常的現(xiàn)象。
3.9 高溫抑制線 high temperatured line
食用菌菌種在生長(zhǎng)過(guò)程中受高溫的不良影響，培養(yǎng)物出現(xiàn)的圈狀發(fā)黃、發(fā)暗或菌絲變稀弱的現(xiàn)象。
3.10 同工酶 isoenzyme
催化相同生化反應(yīng)，而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶分子。通過(guò)凝膠電泳使同工酶分離成遷移率不同的區(qū)帶，經(jīng)生物化學(xué)染色后顯示出的同工酶譜，可對(duì)生物品種進(jìn)行酶分子水平的鑒別或鑒定。

4 質(zhì)量要求 
4.1母種 
4.1.1　容器規(guī)格 采用18 mmX180mm、20mm X200mm的玻璃試管。
4.1.2　培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），按GB4789.28中4.79規(guī)定配置。　　

4.1.3感官指標(biāo) 符合表1規(guī)定。
表1
項(xiàng)目要求
棉塞或無(wú)棉塑料蓋干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
培養(yǎng)基灌入量 為試管總體積的十分之一至五分之一
培養(yǎng)基斜面長(zhǎng)度為試管總長(zhǎng)度的二分之一至五分之一 
斜面接種塊大小 3~5mmX3~5mm 
                            
培養(yǎng)基斜面 正面外觀 
菌絲體特征 潔白或米白、濃密、羽毛狀或葉脈狀
菌絲體表面 均勻、平整、無(wú)角變
菌絲分泌物 無(wú)菌落邊緣整齊，無(wú)膏狀、蠟狀細(xì)菌或酵母菌菌落及霉菌菌落
培養(yǎng)基斜面背面外觀 培養(yǎng)基不干縮，顏色均勻、無(wú)暗斑、無(wú)色素
培養(yǎng)物氣味有雙孢蘑菇菌種特有的香味，無(wú)酸、臭、霉等異味
培養(yǎng)物鏡檢 菌絲粗壯，無(wú)雜菌菌絲及孢子，無(wú)蟲(chóng)及蟲(chóng)卵。
4.1.4　菌絲生長(zhǎng)速度 在適溫（24℃±1℃）下，15－20天長(zhǎng)滿試管。
4.1.5 母種遺傳和栽培性狀 供種單位，母種需經(jīng)酯酶(Est)同工酶類型鑒定，確認(rèn)其遺傳類型與對(duì)照相同后，需再經(jīng)出菇試驗(yàn)確定產(chǎn)量及品質(zhì)等栽培農(nóng)藝性狀合格后，方可用于擴(kuò)大繁殖或出售。
4.1.5.1菌絲體Est同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳類型包括G型(呈現(xiàn)e1,e3特征帶)、H型(呈現(xiàn)e2,e4和e30-33特征帶)、HG1~HG2型(呈現(xiàn)e1,e3,e30-33特征帶)和HG4型(呈現(xiàn)e1,2,3,4和e30-33特征帶)等。以Est區(qū)帶向正極泳動(dòng)距離與溴酚藍(lán)指示劑向正極泳動(dòng)距離的比值作為電泳相對(duì)遷移率(Rm)。e1,e2,e3,e4,e30,e31,e32和e33的Rm值分別分0.820,0.810,0.760,0.750,0.128,0.100,0.070和0.010。

4.1.5.2 菌絲萌發(fā)、定植能力 接種到適合的培養(yǎng)基后，在正常條件下24小時(shí)內(nèi)萌發(fā)恢復(fù)，定植迅速、菌絲健壯，20天以內(nèi)長(zhǎng)滿培養(yǎng)基。
4.1.5.3 結(jié)菇轉(zhuǎn)潮能力 覆土后12～16天結(jié)菇，分布均勻；18～22天采菇，每潮菇間隔7～10天。
4.1.5.4 抗逆性 對(duì)溫度、濕度、酸堿度等生長(zhǎng)條件變化耐受能力較強(qiáng)；對(duì)主要病蟲(chóng)害的抵抗能力較強(qiáng)。 
4.1.5.5 生物學(xué)效率 在正常條件下生物學(xué)效率不低于30%。
4.2　原種
4.2.1　容器規(guī)格 玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶，分別符合3.6和3.7規(guī)定。 
4.2.2　培養(yǎng)基
4.2.2.1　腐熟麥桿或稻桿(干)77%，腐熟牛糞粉(干)20%,石膏粉1%,碳酸鈣2%,含水量62%±1%,pH7.5。

4.2.2.2 腐熟棉籽殼（干）97%，石膏粉1%, 碳酸鈣2%, 含水量55%±1%, pH7.5。 
4.2.3　感官指標(biāo) 符合表2規(guī)定。
表2
項(xiàng)目 要求
棉塞或無(wú)棉塑料蓋 干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
培養(yǎng)基上表面距瓶口的距離 50 mm±5mm
接種量 每支母種接原種 4－6瓶
菌種瓶外觀菌絲體特征 潔白濃密、生長(zhǎng)旺健
培養(yǎng)物表面菌絲體生長(zhǎng)均勻，無(wú)角變，無(wú)高溫抑制線
培養(yǎng)基及菌絲體緊貼瓶壁，無(wú)干縮
培養(yǎng)物表面分泌物 無(wú)
各種雜菌孢子、菌絲 無(wú)
拮抗現(xiàn)象 無(wú)
培養(yǎng)物氣味 有蘑菇菌種特有的香味，無(wú)酸、臭、霉等異味
培養(yǎng)物鏡檢 菌絲粗壯、無(wú)雜菌菌絲和孢子、無(wú)蟲(chóng)及蟲(chóng)卵
4.2.4菌絲生長(zhǎng)速度：原種瓶應(yīng)發(fā)滿菌絲，在適溫（24℃±1℃）下菌絲長(zhǎng)滿瓶不超過(guò)45天。
4.3 栽培種
4.3.1　容器規(guī)格：
玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶，也可采用不小于15cm×28cm，厚0.04mm-0.06mm的聚丙烯塑料袋。塑料袋的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)符合GB9687和GB9688規(guī)定。

4.3.2　培養(yǎng)基 除同4.2.2.1和4.2.2.2外，另可用以下兩種。
4.3.2.1 谷粒98%，石膏粉2%, 含水量50%±1%, pH7.5～8.0。
4.3.2.2 其它經(jīng)省級(jí)或省級(jí)以上鑒定適合于雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
4.3.3感官指標(biāo) 符合表3規(guī)定。
表3
項(xiàng)目要求
棉塞或無(wú)棉塑料蓋 干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
培養(yǎng)基面距瓶（袋）口的距離 50 mm±5mm
接種量 每瓶原種接栽培種 30－50瓶（袋）
菌種瓶（袋） 外觀
菌絲體特征 潔白濃密、生長(zhǎng)旺健
不同部位菌絲體 生長(zhǎng)均勻，無(wú)角變，無(wú)高溫抑制線
培養(yǎng)基及菌絲體 緊貼瓶（袋）壁，無(wú)干縮
培養(yǎng)物表面分泌物 無(wú)
各種雜菌孢子、菌絲 無(wú)
拮抗現(xiàn)象 無(wú)
培養(yǎng)物氣味 有蘑菇菌種特有的香味，無(wú)酸、臭、霉等異味
培養(yǎng)物鏡檢 菌絲粗壯、無(wú)雜菌菌絲和孢子、無(wú)蟲(chóng)及蟲(chóng)卵 
4.3.4 菌絲生長(zhǎng)速度栽培種瓶（袋）應(yīng)發(fā)滿菌絲，在適溫（24℃±1℃）下菌絲長(zhǎng)滿菌種瓶（袋）不超過(guò)45天。
4.3.5 種源應(yīng)使用通過(guò)省級(jí)或省級(jí)以上菌種審定委員會(huì)審定、認(rèn)定或登記的品種，并從具有相應(yīng)技術(shù)資質(zhì)的供種單位引種。
5 抽樣 
5.1質(zhì)檢部門的抽樣應(yīng)具有代表性。
5.2母種按品種、培養(yǎng)條件、接種時(shí)間分批編號(hào)，原種、栽培種按菌種來(lái)源、制種方法和接種時(shí)間分批編號(hào)。按批隨機(jī)抽取被檢樣品。

5.3母種、原種、栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%，5%，1%。但每批抽樣數(shù)量不得少于10支、瓶（袋）；超過(guò)100支、瓶（袋）的，可進(jìn)行兩級(jí)抽樣。

6 試驗(yàn)方法 
6.1 感官檢驗(yàn)
6.1.3表1、表2、表3中除接種量、培養(yǎng)物氣味和培養(yǎng)物鏡檢三項(xiàng)外的各項(xiàng)，用肉眼或5X放大鏡觀察。
6.1.4表1、表2、表3中培養(yǎng)物氣味，以鼻嗅判斷。
6.1.5表1、表2、表3中培養(yǎng)物鏡檢，用放大倍數(shù)不低于10X40的光學(xué)顯微鏡對(duì)培養(yǎng)物的水封片進(jìn)行觀察，每一檢樣應(yīng)觀察不少于30個(gè)視野。

6.1.6表2、表3中接種量，需察看菌種廠的生產(chǎn)紀(jì)錄。
6.2細(xì)菌檢驗(yàn)
取少量疑有細(xì)菌污染的培養(yǎng)物，按無(wú)菌操作接入GB4789.28中4.8規(guī)定的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，25℃-28℃振蕩培養(yǎng)1－2天，觀察培養(yǎng)液是否混濁。培養(yǎng)液混濁，為有細(xì)菌污染；培養(yǎng)液澄清，為無(wú)細(xì)菌污染。

6.3母種遺傳和栽培性狀檢驗(yàn)
6.3.1 Est同工酶鑒定取菌齡為15-20天的試管母種, 刮取菌絲, 按1:3:0.5的比例混合菌絲(g)、0.1Mol/L磷酸緩沖液(mL)和石英砂(g), 研磨成勻漿, 臺(tái)式離心機(jī)10000r/min離心5min, 取上清液, 按5:1:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%溴酚藍(lán)溶液作為電泳樣品, 4℃下冷藏備用。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。用pH8.9Tris-HCl緩沖液配制9%分離膠,用pH8.3Tris-甘氨酸作電極緩沖液。點(diǎn)樣75uL, 3℃下120V電泳20min后穩(wěn)壓200V, 4h。用固藍(lán)RR鹽60mg, 0.1Mol/L磷酸緩沖液(pH6.0) 80mL α-萘乙酯38mg和β-萘乙酯38mg溶于3mL丙酮配制的染色液染色,顯現(xiàn)酶譜,再根據(jù)特征帶分型。
6.3.2 栽培性狀 
將被檢母種制成原種。采用4.2.2.1的培養(yǎng)基配方（含水量提高到68%），配制360千克培養(yǎng)基, 接種后分3組(每組2M2)進(jìn)行常規(guī)管理，根據(jù)表4所列項(xiàng)目，做好栽培記錄，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)將該母種的出發(fā)菌株設(shè)為對(duì)照，亦做同樣處理。對(duì)比二者的檢驗(yàn)結(jié)果，以時(shí)間計(jì)的檢驗(yàn)項(xiàng)目中，被檢母種的任何一項(xiàng)時(shí)間較對(duì)照菌株推遲5天以上（含5天）者，為不合格；產(chǎn)量性狀差異顯著低于對(duì)照菌株者，為不合格；菇體外觀形態(tài)與對(duì)照明顯不同或畸形者，為不合格。

表4 
                            
檢驗(yàn)項(xiàng)目 檢驗(yàn)結(jié)果 檢驗(yàn)項(xiàng)目 檢驗(yàn)結(jié)果
母種發(fā)滿所需時(shí)間，天 
轉(zhuǎn)潮間隔時(shí)間，天
原種發(fā)滿所需時(shí)間，天總產(chǎn)，Kg
栽培種發(fā)滿所需時(shí)間，天
平均單產(chǎn)，Kg
菌種萌發(fā)所需時(shí)間，天
平均單菇重，g
菌絲發(fā)滿培養(yǎng)基所需時(shí)間，天
生物學(xué)效率，%
覆土至扭結(jié)所需時(shí)間，天菇型、色澤
覆土至采菇所需時(shí)間，天菇蓋直徑、厚度、柄長(zhǎng)、柄的直徑，mm
6.4留樣
各級(jí)菌種要留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)每個(gè)批號(hào)母種3-5支，原種和栽培種5-7瓶，于4℃-6℃下貯存，母種5個(gè)月，原種4個(gè)月，栽培種2個(gè)月。

7 檢驗(yàn)規(guī)則 
7.1判定規(guī)則按質(zhì)量要求進(jìn)行。檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合質(zhì)量要求時(shí)，為合格菌種，其中任何一項(xiàng)不符合要求，均為不合格菌種。
8 標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存 
8.1標(biāo)志
8.1.1產(chǎn)品標(biāo)志 每支、瓶（袋）菌種要貼有清晰注明以下要素的標(biāo)志。
a. 產(chǎn)品名稱（雙孢蘑菇母種）
b. 品種名稱（As2796）
c. 生產(chǎn)單位（xxx菌種廠）
d. 接種日期（2000.xx.xx）　　
8.1.2包裝標(biāo)志 每箱菌種要貼有清晰注明以下要素的包裝標(biāo)志。
a. 產(chǎn)品名稱、品種名稱
b. 廠名、廠址、聯(lián)系電話
c. 出廠日期
d. 保質(zhì)期、貯存條件、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)
e. 發(fā)貨單位
f.收貨單位
g. 數(shù)量
h. 毛重、凈重
i. 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn) 
8.1.3 包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示 按GB191規(guī)定，應(yīng)注明以下圖示標(biāo)志：
a. 小心輕放標(biāo)志
b.防水防潮防凍標(biāo)志
c.防曬防高溫標(biāo)志
d.防止倒置標(biāo)志
e.防止重壓標(biāo)志
8.2 包裝
8.2.1　母種外包裝采用木盒或有足夠強(qiáng)度的紙材制做的紙箱，內(nèi)部用棉花、碎紙、報(bào)紙等具有緩沖作用的輕質(zhì)材料填滿。

8.2.2　原種、栽培種外包裝采用有足夠強(qiáng)度的紙材制做的紙箱，每箱20瓶，內(nèi)部用碎紙、報(bào)紙等具有緩沖作用的輕質(zhì)材料填滿。紙箱上部和底部用8cm寬的膠帶封口，并用打包帶捆扎兩道，箱內(nèi)附產(chǎn)品合格證書和使用說(shuō)明（包括菌種種性、培養(yǎng)基配方及適用范圍）。

8.3　運(yùn)輸
8.3.1　不得與有毒物品混裝。
8.3.2　氣溫達(dá)30℃以上時(shí)，需用2℃-20℃的冷藏車運(yùn)輸。 
8.3.3　運(yùn)輸中須有防震、防曬、防雨淋、防凍、防雜菌污染的措施。
8.4 貯存
8.4.1　母種一般在5℃±1℃冰箱中貯存，保藏期不超過(guò)90天。 
8.4.2　原種應(yīng)盡快使用，10天內(nèi)可在溫度24℃±1℃、清潔、通風(fēng)、干燥(相對(duì)濕度70%-75%)、避光的室內(nèi)存放。在5℃±1℃下貯存，保藏期不超過(guò)40天。 
8.4.3 栽培種應(yīng)盡快使用，在溫度24℃±1℃、清潔、通風(fēng)、干燥(相對(duì)濕度70%-75%)、
避光的室內(nèi)存放谷粒種不超過(guò)10天，其余培養(yǎng)基的栽培種不超過(guò)20天。在5℃±1℃下可貯存90天。

編輯：黑子