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液體發(fā)酵技術(shù)屬于現(xiàn)代生物技術(shù)之一。  深層發(fā)酵技術(shù)直接生產(chǎn)食用菌菌體，同時(shí)獲得富含氨基酸等營養(yǎng)成分的發(fā)酵液。



　　一、深層發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇



　　1、食用菌液體深層發(fā)酵技術(shù)研究的關(guān)鍵是培養(yǎng)基。不同食用菌要用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，因此，培養(yǎng)基的選擇與配制是食用菌液體深層發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵。



　　食用菌的深層液體發(fā)酵生產(chǎn)主要是采用了抗生素生產(chǎn)的工藝和設(shè)備，其工藝大致是：母種——一級種子——二級種子——發(fā)酵罐深層發(fā)酵



　　根據(jù)培養(yǎng)基組成的不同，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基的組成均為天然有機(jī)物，合成培養(yǎng)基則是采用一些已知化合成分的營養(yǎng)物質(zhì)作為培養(yǎng)基，無論哪一種培養(yǎng)基，其組成都離不開碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素、維生素和生長素等。



　　2、選擇培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的問題



　　(1)  氮源過多會引起菌絲生長過于旺盛，不利于代謝產(chǎn)物的積累。碳源不足，又容易引起菌體衰老和自溶，碳、氮比不當(dāng)，會影響菌絲按比例地吸收營養(yǎng)物質(zhì)。



　　(2)  同一種原料因產(chǎn)地不同其營養(yǎng)成分有差異，這在氮源表現(xiàn)得較明顯，如大豆、玉米漿、蛋白陳等，必須記下每一種原料的產(chǎn)地、批號、生產(chǎn)廠等，并對原料進(jìn)行化學(xué)成分分析。



　　(3)  水質(zhì)對發(fā)酵生產(chǎn)的影響也很大，自來水、地表水、河水、并水、雪水等，其中所含溶解氧、金屬離子及酸堿度等均有差異。另外，有的水中還含有較多的氯離了。因此應(yīng)對水質(zhì)進(jìn)行化學(xué)分析。



　　(4)  高溫(或高壓)滅菌會引起某些營養(yǎng)成分的破壞，特別是還原糖、氨基酸和肽類等共同加熱時(shí)，會形成與—羥甲基糠醛及類黑精等物質(zhì)。賴氨酸最容易與糖發(fā)生反應(yīng)，形成棕色物。這些在選擇培養(yǎng)基及滅菌時(shí)都應(yīng)預(yù)先想到。



　　二、食用菌的搖瓶培養(yǎng)



　　將食用菌的試管母種接人已滅菌的三角瓶培養(yǎng)液中，然后置于搖床上振蕩培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式即為搖瓶培養(yǎng)。經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)的菌絲體呈球狀、絮狀等多種形態(tài)。培養(yǎng)液可呈糊狀，消液狀等狀態(tài)，有或無清香味及其他異味。菌液中有菌株發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，可呈不同的顏色。在進(jìn)行菌株的初期培養(yǎng)或生理生代研究時(shí)，一般皆采用搖瓶培養(yǎng)法。



　　影響搖瓶培養(yǎng)菌絲體及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的因素有：培養(yǎng)溫度、搖床的振蕩頻率和瓶子的裝料系數(shù)、pH值、菌齡、接種量、培養(yǎng)液的粘度和光照等。



　　三、  食用菌的發(fā)酵罐深層培養(yǎng)



　　發(fā)酵罐深層培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、效益大等優(yōu)點(diǎn)，是食用菌進(jìn)行大量生產(chǎn)的重要途徑。



　　1、  深層發(fā)酵的一般設(shè)備。



　　深層發(fā)酵生產(chǎn)要住發(fā)酵罐內(nèi)不斷地輸入無菌空氣以保證耗氧的需要及維持罐內(nèi)有一定的壓力，防止外界雜菌的侵入，發(fā)酵生產(chǎn)必須具有如下設(shè)備：



　　（1）  滅菌消毒設(shè)備



　　滅菌的方法很多，但食用菌的發(fā)酵生產(chǎn)中多采用“空消和實(shí)消”滅菌形式：空消即對發(fā)酵罐及管道進(jìn)行空著消毒。實(shí)消即培養(yǎng)液置于發(fā)酵罐內(nèi)用高壓蒸汽消毒，其優(yōu)點(diǎn)是只需蒸汽發(fā)生器這一專業(yè)設(shè)備，操作比較簡便，其缺點(diǎn)是由于是在高溫下且長時(shí)間的情況進(jìn)行滅菌，故培養(yǎng)液極易發(fā)生過熱而導(dǎo)致營養(yǎng)成分破壞。



　　（2）  空氣凈化設(shè)備



　　發(fā)酵生產(chǎn)要求進(jìn)入罐體的空氣須是潔凈無菌的干燥空氣，由于空氣壓縮機(jī)輸出的空氣溫度高，且含有雜菌、油、水等，因此必須經(jīng)過處理后，才能進(jìn)入罐體。



　　生產(chǎn)上壓縮空氣的凈化過程大同小異，多數(shù)處理方法為：(1)壓縮空氣通過一冷卻器降溫。(2)通過一個油、水分離器，除去空氣中的大部分油和水。(3)空氣進(jìn)人一個較大容積的空氣貯罐，空氣貯罐一則可使壓縮空氣進(jìn)一步冷卻，二則對整個空氣系統(tǒng)的壓力起到緩沖和平衡作用。(4)通過一個冷卻器和塞有棉塞介質(zhì)的去污器。(5)空氣進(jìn)人總過濾器內(nèi)進(jìn)行過濾除菌。



　　壓縮空氣的凈化過程為先通過一個總過濾器(其過濾介質(zhì)必須定期進(jìn)行高壓蒸汽滅菌)，再通過小型的分過濾器，再一次進(jìn)行過濾除菌。



　　（3）  發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備



　　食用菌的發(fā)酵生產(chǎn)多采用二級發(fā)酵與三級發(fā)酵。若按接種量10%計(jì)算，則最終使用的發(fā)酵罐為：一級種子罐50升，二級種子罐500升。發(fā)酵罐5000升。種子罐100升，發(fā)酵罐1000升，一般以二個種子罐以上配一個發(fā)酵罐，這樣一旦一個種子罐染菌了，還有一個種子罐可供備用。種子罐容積越小，搖瓶菌種的接種量越小，污染雜菌的機(jī)率也越小。



　　若用10L、25L的發(fā)酵罐，且多采用三級發(fā)酵，故10L發(fā)酵罐(按75%計(jì)算)所對應(yīng)的二級種子罐為750m1，一級種子罐為75ml。同理，25L的發(fā)酵罐所對應(yīng)的二級種子罐為1800m1，一級種子罐為180ml。



　　（4）后處理設(shè)備



　　深層液體發(fā)酵中，后處理設(shè)備名目繁多，選擇何種設(shè)備視菌株的不同及所得產(chǎn)物的需要而定。如果是生產(chǎn)食用菌的液體菌種用于栽培生產(chǎn)，則只需要將菌液打入已滅菌的密閉器內(nèi)，不必進(jìn)行后處理；如果目的產(chǎn)物是菌絲體，則首先使用板框壓濾機(jī)、離心機(jī)等使發(fā)酵液中的菌絲分離出來，再進(jìn)行烘干，粉碎之后得到菌體干粉末。如果欲得到除去菌絲體的發(fā)酵清液，則將過濾或壓濾后的發(fā)酵清液通過薄膜濃縮器或減壓濃縮器，然后得到濃縮液，再置于夾層蒸煮鍋中進(jìn)一步得到膏狀物，如果目的產(chǎn)物是菌種中或發(fā)酵中的某種次生代謝產(chǎn)物，則必須根據(jù)次生代謝產(chǎn)物的不同提取工藝選擇蒸煮罐離子交換器，萃取罐等設(shè)備。



　　四、  深層發(fā)酵生產(chǎn)的有關(guān)參數(shù)



　　深層發(fā)酵生產(chǎn)與搖瓶液體培養(yǎng)是完全不同的培養(yǎng)方式。搖瓶試驗(yàn)中得到的代謝曲線及各種參數(shù)，只能供發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)參考。在搖瓶試驗(yàn)中可以得到的菌絲含量及次生代謝產(chǎn)物含量，一旦放大到發(fā)酵罐中試驗(yàn)，條件可完全一致。所以，深層液體發(fā)酵時(shí)，應(yīng)參照發(fā)酵罐生產(chǎn)的有關(guān)參數(shù)控制生產(chǎn)。參數(shù)為物理參數(shù)及生物參數(shù)，物理參數(shù)有溫度、壓力、攪拌速度、空氣流量、溶解氧、排氣中氧及二氧化碳含量等；化學(xué)參數(shù)有pH值、糖、氧及次生代謝產(chǎn)物的含量等。生物參數(shù)包括菌絲形態(tài)、發(fā)酵液中菌體含量等。



　　1、  物理參數(shù)



　　（1）溫度  可影響發(fā)酵過程中基質(zhì)的反應(yīng)速率及氧的溶解度。溫度和菌體代謝、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有密切的關(guān)系。不同的菌種及同一菌種在不同的代謝階段，其適宜的溫度也不同，溫度可從溫度自動顯示器或從溫度計(jì)中讀出。



　　（2）壓力  發(fā)酵罐內(nèi)維持一定的壓力可控制壓力為0時(shí)雜菌的污染，并且可增加溶液中的溶解氧。但二氧化碳在水中的溶解度比氧大很多，因此罐壓不宜太高，食用茵的發(fā)酵生產(chǎn)，罐壓一般控制在0.3—0.5MPa左右，罐壓可在壓力表上顯示。



　　（3）攪拌速度  提高罐體攪拌器的攪拌速度可增強(qiáng)培養(yǎng)液中氧的溶解速率，還可破碎菌體，有利菌絲增殖。但轉(zhuǎn)速過高，菌體機(jī)械破壞過大，也不利于菌絲生長、轉(zhuǎn)速可通過改變變速電動機(jī)來調(diào)節(jié)。



　　（4）空氣流量  無菌空氣是食用菌發(fā)酵生產(chǎn)中氧的來源。不同菌種及同一菌種在不同的生長階段所需要的通氣量不同。培養(yǎng)基裝量愈多，通氣情況愈差，菌絲生長也愈慢。如增加通氣量，可提高菌絲體產(chǎn)量。實(shí)踐證明，靈芝的菌絲生長對氧氣的要求要比其它食用菌高一點(diǎn)。一般采用空氣流量為0.5：1—1：1V／Vmin。



　　（5）溶解氧  發(fā)酵過程中的溶解氧濃度大小和氧的傳遞速率與菌株的耗氧相關(guān)。溶解氧用于了解發(fā)酵菌株對氧的利用規(guī)律，指示發(fā)酵的異常情況。溶解氧用插入發(fā)酵液中的溶解氧電極測定。



　　（6）排氣中氧及二氧化碳含量  測定排氣中氧的含量，可以計(jì)算出菌體耗氧率。測定排氣中二氧化碳，再結(jié)合產(chǎn)生菌的耗氧率，可以了解菌體的呼吸規(guī)律。



　　2、化學(xué)參數(shù)



　　（1）pH值  發(fā)酵液的pH值是發(fā)酵過程中各種生化反應(yīng)的綜合指標(biāo)。了解該值的變化規(guī)律，可了解茵體的生長規(guī)律及代謝特征，pH值一般通過取樣測定。



　　（2）糖  發(fā)酵液中總糖和還原糖的變化規(guī)律，可通過化學(xué)測定法測得。通過對還原糖的變化規(guī)律的分析可了解菌體對碳源的吸收利用情況，而發(fā)酵液中多糖的含量高低是反應(yīng)發(fā)酵好壞的一個指標(biāo)。



　　（3）氧  發(fā)酵液中氨基氯的變化顯示出發(fā)酵液中氮源的變化規(guī)律，其含量的測定主要是通過取樣后采用化學(xué)方法進(jìn)行測定。但隨著發(fā)酵工業(yè)中的膜分離技術(shù)的推廣，將代替以前那復(fù)雜而繁瑣的化學(xué)方法。



　　（4）次生代謝產(chǎn)物  如果發(fā)酵生產(chǎn)的目的產(chǎn)物是某種次生代謝產(chǎn)物，那么通過對該產(chǎn)物的化學(xué)測定，可判斷次生代謝產(chǎn)物與菌體生長關(guān)系以及與各參數(shù)之間的聯(lián)系，為確定最佳生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。



　　3、生物參數(shù)



　　（1）菌絲形態(tài)  通過發(fā)酵的取樣液的鏡檢，觀察菌絲形態(tài)的變化，從中可以了解菌絲的長勢及是否已經(jīng)衰老或自溶。



　　（2）  菌絲含量  可通過菌絲含量的測定，了解菌絲生長狀況以及和各參數(shù)之間的關(guān)系。為確定最佳生產(chǎn)條件及生產(chǎn)工藝也提供了科學(xué)依據(jù)。



　　4、  深層發(fā)酵生產(chǎn)中某些參數(shù)的控制



　　由于各參數(shù)之間存在內(nèi)在的聯(lián)系，所以實(shí)際生產(chǎn)中對發(fā)酵過程的控制，主要是對以下幾個參數(shù)的控制。



　　（1）溫度的控制



　　發(fā)酵過程中，影響發(fā)酵液溫度變化的因素很多。溫度是各因素綜合作用的結(jié)果。  菌體生長代謝過程中會消耗養(yǎng)分，釋放能量。其中一部分能量供自身消耗，一部分則以熱的形式散發(fā)出來，稱為生物熱(Q生物)



　　攪拌是因機(jī)械摩擦產(chǎn)生熱，稱為攪拌熱(Q攪發(fā)酵液中水會蒸發(fā)會吸收熱，稱蒸發(fā)熱(Q蒸)



　　排出氣體會帶走熱量，稱顯熱(Q顯)



　　發(fā)酵罐內(nèi)外溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射，稱輻射熱(Q輻射)  因此，發(fā)酵液中體現(xiàn)溫度變化的發(fā)酵熱(Q發(fā)酵)應(yīng)該符合下述公式：



　　Q發(fā)酵＝Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q顯-Q輻射



　　如果發(fā)酵過程中，溫度出現(xiàn)異常情況，可根據(jù)此公式，進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。



　　一般情況下，控制發(fā)酵生產(chǎn)的溫度均采用往發(fā)酵罐夾層中注入熱水或冷水的方式升溫或降溫，比較先進(jìn)的控溫設(shè)備是由電腦控制的。



　　（2）溶氧濃度的控制



　　溶氧濃度是發(fā)酵生產(chǎn)中十分敏感的一個參數(shù)，由于影響供氧及耗氧的因素都會使發(fā)酵液中溶氧濃度發(fā)生變化，所以通過溶氧濃度的變化來了解發(fā)酵過程中菌絲生長及生化反應(yīng)變化是十分有效的。如果設(shè)備的供氧不變，那么溶解氧的變化就反映出發(fā)酵菌體呼吸量的增減。一般情況下，在發(fā)酵前期，由于菌體大量繁殖，耗氧增加，表現(xiàn)為溶氧濃度明顯下降，到了中期，溶氧濃度逐漸回升，發(fā)酵后期，耗氧減少，溶氧上升。一旦菌體自溶，溶氧濃度明顯上升。菌液中的溶氧濃度，除了和通氣量密切相關(guān)外，還和氧在液體中的溶解及傳遞相關(guān)聯(lián)。而氧的傳遞和溶解，也受到某些因素的制約。如溫度越低，氧的溶解度越高。攪拌速度增快，有助于溶氧濃度的增加，培養(yǎng)基中溶質(zhì)越多，氧的溶解度越小等。



　　由于無法測定菌體中的溶氧濃度，則無法提供每一時(shí)期精確的通氣量，在食用茵的發(fā)酵生產(chǎn)中，采取了前期通氣量小，中期通氣量大，后期通氣量小的方式，小通氣量，一般為0.5V/Vmin，大通氣量一般為1.5V/Vmin。



　　（3）攪拌速度的控制



　　通過攪拌，能把從空氣分布管中引入的空氣力成氣泡，增加氣—液的接觸面積，從而增加氧的傳遞還可使液體形成渦流，延長氣泡在液體中的停留時(shí)間，增加液體的湍動程度，降低氣泡周圍的液膜E力，增大氧的傳遞系數(shù)，此外，還可減少菌絲結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，改善細(xì)胞對氧的吸收。



　　據(jù)報(bào)道，在食用菌液體深層培養(yǎng)中，采用通氣攪拌的方式比機(jī)械攪拌好；采用間歇攪拌方式比連續(xù)攪拌效果更好。



　　攪拌速度大，溶解氧就多，但過大的攪拌速度，對菌體的破壞會很厲害。顯然，對某些菌種，由于攪拌帶來的破壞作用將超過因镕氧增加帶來的促進(jìn)生長作用，因此不攪拌反而更好。攪拌速度的快慢，因菌株不同而異。如果靈芝菌的深層培養(yǎng)，攪拌不僅影響菌絲的形態(tài)，還影響靈芝多糖的產(chǎn)生。隨著攪拌速度的提高，靈芝胞外多糖的產(chǎn)量增加，而胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量下降。



　　（4）pH值的控制



　　當(dāng)了解到菌株在發(fā)酵各時(shí)期的合適pH值后，就應(yīng)想辦法滿足其對酸堿度的要求。首先可以考慮在培養(yǎng)基配方中加入某物質(zhì)以維持pH值的恒定。此外，還可以通過補(bǔ)料的方式來調(diào)節(jié)pH值。



　　（5）泡沫的控制



　　泡沫是深層發(fā)酵的最大障礙，它不僅造成大量跑液，浪費(fèi)原料，還增加污染機(jī)會。消除泡沫的方法有機(jī)械消沫及加消沫劑兩種方法。



　　機(jī)械消沫法是在攪拌軸上方安裝消沫器，形式多樣，但效率都不高，特別是對粘性液態(tài)泡沫幾乎不起作用。消沫劑有天然油脂類：高碳醇、脂肪酸和酯類；聚醚類；硅酮類等四大類。



　　生產(chǎn)上并非一見泡沫就用消泡劑，有時(shí)通過減少通氣量，停止攪拌等方式亦能控制泡沫，改變培養(yǎng)基的成分，亦是減少泡沫的較佳辦法。總之，應(yīng)摸清產(chǎn)生泡沫的原因，有針對性地采取最佳消沫方式，盡可能少用消沫油或消沫劑。



　　五、發(fā)酵終點(diǎn)的判斷



　　在以菌絲為目的物的發(fā)酵生產(chǎn)中，將以菌絲體的得串為控制指標(biāo)，發(fā)酵終點(diǎn)的判斷以菌絲形態(tài)、數(shù)量以及養(yǎng)分的消耗和代謝的變化作為指標(biāo)。



　　1、  形態(tài)觀



　　(1)菌絲鏡檢  在深層培養(yǎng)的早期和中期，菌絲粗狀，分枝較少，著色深，有鎖狀聯(lián)合。而后期菌絲變細(xì)，并有大量分枝產(chǎn)生，色淺，出現(xiàn)較多空泡，少量存在鎖狀聯(lián)合，這是菌絲衰老的象征，應(yīng)在此之前放罐。



　　(2)菌球觀察  菌絲疏松或緊密地集合在一起，或網(wǎng)狀，肉眼觀察即為菌球。菌球已經(jīng)中空，表明菌球中部菌絲已老化，部分菌絲自溶，菌球變得光滑，菌球的額色由淺變深，也是老化的象征。



　　(3)菌絲含量測定  選擇菌絲含量不再增加前的某一時(shí)刻放罐，是一個比較容易掌握的控制指標(biāo)。



　　在實(shí)際生產(chǎn)及試驗(yàn)中一般以菌絲含量達(dá)到某一定值為指標(biāo)，再結(jié)合菌絲及菌球的觀察結(jié)果為參考指標(biāo)，判斷是否到發(fā)酵終點(diǎn)。



　　2、  食用菌深層培養(yǎng)中代謝變化



　　在發(fā)酵過程中pH值、氨基氮、糖及其他有效成分含量都隨菌齡的變化而變化，根據(jù)上述數(shù)據(jù)的變化，制作一條代謝曲線，此曲線對指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)的進(jìn)行，確定發(fā)酵終點(diǎn)有重要作用。但對于以次生代謝產(chǎn)物為目的產(chǎn)物的深層發(fā)酵時(shí)，一般都在目的產(chǎn)物達(dá)到最大值時(shí)才終止發(fā)酵