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液體發酵技術屬于現代生物技術之一。  深層發酵技術直接生產食用菌菌體，同時獲得富含氨基酸等營養成分的發酵液。



　　一、深層發酵培養基的選擇



　　1、食用菌液體深層發酵技術研究的關鍵是培養基。不同食用菌要用不同的培養基進行培養，因此，培養基的選擇與配制是食用菌液體深層發酵技術的關鍵。



　　食用菌的深層液體發酵生產主要是采用了抗生素生產的工藝和設備，其工藝大致是：母種——一級種子——二級種子——發酵罐深層發酵



　　根據培養基組成的不同，可分為天然培養基和合成培養基。天然培養基的組成均為天然有機物，合成培養基則是采用一些已知化合成分的營養物質作為培養基，無論哪一種培養基，其組成都離不開碳源、氮源、無機鹽、微量元素、維生素和生長素等。



　　2、選擇培養基時應注意的問題



　　(1)  氮源過多會引起菌絲生長過于旺盛，不利于代謝產物的積累。碳源不足，又容易引起菌體衰老和自溶，碳、氮比不當，會影響菌絲按比例地吸收營養物質。



　　(2)  同一種原料因產地不同其營養成分有差異，這在氮源表現得較明顯，如大豆、玉米漿、蛋白陳等，必須記下每一種原料的產地、批號、生產廠等，并對原料進行化學成分分析。



　　(3)  水質對發酵生產的影響也很大，自來水、地表水、河水、并水、雪水等，其中所含溶解氧、金屬離子及酸堿度等均有差異。另外，有的水中還含有較多的氯離了。因此應對水質進行化學分析。



　　(4)  高溫(或高壓)滅菌會引起某些營養成分的破壞，特別是還原糖、氨基酸和肽類等共同加熱時，會形成與—羥甲基糠醛及類黑精等物質。賴氨酸最容易與糖發生反應，形成棕色物。這些在選擇培養基及滅菌時都應預先想到。



　　二、食用菌的搖瓶培養



　　將食用菌的試管母種接人已滅菌的三角瓶培養液中，然后置于搖床上振蕩培養，這種培養方式即為搖瓶培養。經過搖瓶培養的菌絲體呈球狀、絮狀等多種形態。培養液可呈糊狀，消液狀等狀態，有或無清香味及其他異味。菌液中有菌株發酵產生的次生代謝產物，可呈不同的顏色。在進行菌株的初期培養或生理生代研究時，一般皆采用搖瓶培養法。



　　影響搖瓶培養菌絲體及次生代謝產物產生的因素有：培養溫度、搖床的振蕩頻率和瓶子的裝料系數、pH值、菌齡、接種量、培養液的粘度和光照等。



　　三、  食用菌的發酵罐深層培養



　　發酵罐深層培養具有生產周期短、產量高、效益大等優點，是食用菌進行大量生產的重要途徑。



　　1、  深層發酵的一般設備。



　　深層發酵生產要住發酵罐內不斷地輸入無菌空氣以保證耗氧的需要及維持罐內有一定的壓力，防止外界雜菌的侵入，發酵生產必須具有如下設備：



　　（1）  滅菌消毒設備



　　滅菌的方法很多，但食用菌的發酵生產中多采用“空消和實消”滅菌形式：空消即對發酵罐及管道進行空著消毒。實消即培養液置于發酵罐內用高壓蒸汽消毒，其優點是只需蒸汽發生器這一專業設備，操作比較簡便，其缺點是由于是在高溫下且長時間的情況進行滅菌，故培養液極易發生過熱而導致營養成分破壞。



　　（2）  空氣凈化設備



　　發酵生產要求進入罐體的空氣須是潔凈無菌的干燥空氣，由于空氣壓縮機輸出的空氣溫度高，且含有雜菌、油、水等，因此必須經過處理后，才能進入罐體。



　　生產上壓縮空氣的凈化過程大同小異，多數處理方法為：(1)壓縮空氣通過一冷卻器降溫。(2)通過一個油、水分離器，除去空氣中的大部分油和水。(3)空氣進人一個較大容積的空氣貯罐，空氣貯罐一則可使壓縮空氣進一步冷卻，二則對整個空氣系統的壓力起到緩沖和平衡作用。(4)通過一個冷卻器和塞有棉塞介質的去污器。(5)空氣進人總過濾器內進行過濾除菌。



　　壓縮空氣的凈化過程為先通過一個總過濾器(其過濾介質必須定期進行高壓蒸汽滅菌)，再通過小型的分過濾器，再一次進行過濾除菌。



　　（3）  發酵生產設備



　　食用菌的發酵生產多采用二級發酵與三級發酵。若按接種量10%計算，則最終使用的發酵罐為：一級種子罐50升，二級種子罐500升。發酵罐5000升。種子罐100升，發酵罐1000升，一般以二個種子罐以上配一個發酵罐，這樣一旦一個種子罐染菌了，還有一個種子罐可供備用。種子罐容積越小，搖瓶菌種的接種量越小，污染雜菌的機率也越小。



　　若用10L、25L的發酵罐，且多采用三級發酵，故10L發酵罐(按75%計算)所對應的二級種子罐為750m1，一級種子罐為75ml。同理，25L的發酵罐所對應的二級種子罐為1800m1，一級種子罐為180ml。



　　（4）后處理設備



　　深層液體發酵中，后處理設備名目繁多，選擇何種設備視菌株的不同及所得產物的需要而定。如果是生產食用菌的液體菌種用于栽培生產，則只需要將菌液打入已滅菌的密閉器內，不必進行后處理；如果目的產物是菌絲體，則首先使用板框壓濾機、離心機等使發酵液中的菌絲分離出來，再進行烘干，粉碎之后得到菌體干粉末。如果欲得到除去菌絲體的發酵清液，則將過濾或壓濾后的發酵清液通過薄膜濃縮器或減壓濃縮器，然后得到濃縮液，再置于夾層蒸煮鍋中進一步得到膏狀物，如果目的產物是菌種中或發酵中的某種次生代謝產物，則必須根據次生代謝產物的不同提取工藝選擇蒸煮罐離子交換器，萃取罐等設備。



　　四、  深層發酵生產的有關參數



　　深層發酵生產與搖瓶液體培養是完全不同的培養方式。搖瓶試驗中得到的代謝曲線及各種參數，只能供發酵生產時參考。在搖瓶試驗中可以得到的菌絲含量及次生代謝產物含量，一旦放大到發酵罐中試驗，條件可完全一致。所以，深層液體發酵時，應參照發酵罐生產的有關參數控制生產。參數為物理參數及生物參數，物理參數有溫度、壓力、攪拌速度、空氣流量、溶解氧、排氣中氧及二氧化碳含量等；化學參數有pH值、糖、氧及次生代謝產物的含量等。生物參數包括菌絲形態、發酵液中菌體含量等。



　　1、  物理參數



　　（1）溫度  可影響發酵過程中基質的反應速率及氧的溶解度。溫度和菌體代謝、代謝產物的產生有密切的關系。不同的菌種及同一菌種在不同的代謝階段，其適宜的溫度也不同，溫度可從溫度自動顯示器或從溫度計中讀出。



　　（2）壓力  發酵罐內維持一定的壓力可控制壓力為0時雜菌的污染，并且可增加溶液中的溶解氧。但二氧化碳在水中的溶解度比氧大很多，因此罐壓不宜太高，食用茵的發酵生產，罐壓一般控制在0.3—0.5MPa左右，罐壓可在壓力表上顯示。



　　（3）攪拌速度  提高罐體攪拌器的攪拌速度可增強培養液中氧的溶解速率，還可破碎菌體，有利菌絲增殖。但轉速過高，菌體機械破壞過大，也不利于菌絲生長、轉速可通過改變變速電動機來調節。



　　（4）空氣流量  無菌空氣是食用菌發酵生產中氧的來源。不同菌種及同一菌種在不同的生長階段所需要的通氣量不同。培養基裝量愈多，通氣情況愈差，菌絲生長也愈慢。如增加通氣量，可提高菌絲體產量。實踐證明，靈芝的菌絲生長對氧氣的要求要比其它食用菌高一點。一般采用空氣流量為0.5：1—1：1V／Vmin。



　　（5）溶解氧  發酵過程中的溶解氧濃度大小和氧的傳遞速率與菌株的耗氧相關。溶解氧用于了解發酵菌株對氧的利用規律，指示發酵的異常情況。溶解氧用插入發酵液中的溶解氧電極測定。



　　（6）排氣中氧及二氧化碳含量  測定排氣中氧的含量，可以計算出菌體耗氧率。測定排氣中二氧化碳，再結合產生菌的耗氧率，可以了解菌體的呼吸規律。



　　2、化學參數



　　（1）pH值  發酵液的pH值是發酵過程中各種生化反應的綜合指標。了解該值的變化規律，可了解茵體的生長規律及代謝特征，pH值一般通過取樣測定。



　　（2）糖  發酵液中總糖和還原糖的變化規律，可通過化學測定法測得。通過對還原糖的變化規律的分析可了解菌體對碳源的吸收利用情況，而發酵液中多糖的含量高低是反應發酵好壞的一個指標。



　　（3）氧  發酵液中氨基氯的變化顯示出發酵液中氮源的變化規律，其含量的測定主要是通過取樣后采用化學方法進行測定。但隨著發酵工業中的膜分離技術的推廣，將代替以前那復雜而繁瑣的化學方法。



　　（4）次生代謝產物  如果發酵生產的目的產物是某種次生代謝產物，那么通過對該產物的化學測定，可判斷次生代謝產物與菌體生長關系以及與各參數之間的聯系，為確定最佳生產工藝提供科學依據。



　　3、生物參數



　　（1）菌絲形態  通過發酵的取樣液的鏡檢，觀察菌絲形態的變化，從中可以了解菌絲的長勢及是否已經衰老或自溶。



　　（2）  菌絲含量  可通過菌絲含量的測定，了解菌絲生長狀況以及和各參數之間的關系。為確定最佳生產條件及生產工藝也提供了科學依據。



　　4、  深層發酵生產中某些參數的控制



　　由于各參數之間存在內在的聯系，所以實際生產中對發酵過程的控制，主要是對以下幾個參數的控制。



　　（1）溫度的控制



　　發酵過程中，影響發酵液溫度變化的因素很多。溫度是各因素綜合作用的結果。  菌體生長代謝過程中會消耗養分，釋放能量。其中一部分能量供自身消耗，一部分則以熱的形式散發出來，稱為生物熱(Q生物)



　　攪拌是因機械摩擦產生熱，稱為攪拌熱(Q攪發酵液中水會蒸發會吸收熱，稱蒸發熱(Q蒸)



　　排出氣體會帶走熱量，稱顯熱(Q顯)



　　發酵罐內外溫度不同，發酵液中有部分熱通過罐體向外輻射，稱輻射熱(Q輻射)  因此，發酵液中體現溫度變化的發酵熱(Q發酵)應該符合下述公式：



　　Q發酵＝Q生物+Q攪拌-Q蒸發-Q顯-Q輻射



　　如果發酵過程中，溫度出現異常情況，可根據此公式，進行相應的調整。



　　一般情況下，控制發酵生產的溫度均采用往發酵罐夾層中注入熱水或冷水的方式升溫或降溫，比較先進的控溫設備是由電腦控制的。



　　（2）溶氧濃度的控制



　　溶氧濃度是發酵生產中十分敏感的一個參數，由于影響供氧及耗氧的因素都會使發酵液中溶氧濃度發生變化，所以通過溶氧濃度的變化來了解發酵過程中菌絲生長及生化反應變化是十分有效的。如果設備的供氧不變，那么溶解氧的變化就反映出發酵菌體呼吸量的增減。一般情況下，在發酵前期，由于菌體大量繁殖，耗氧增加，表現為溶氧濃度明顯下降，到了中期，溶氧濃度逐漸回升，發酵后期，耗氧減少，溶氧上升。一旦菌體自溶，溶氧濃度明顯上升。菌液中的溶氧濃度，除了和通氣量密切相關外，還和氧在液體中的溶解及傳遞相關聯。而氧的傳遞和溶解，也受到某些因素的制約。如溫度越低，氧的溶解度越高。攪拌速度增快，有助于溶氧濃度的增加，培養基中溶質越多，氧的溶解度越小等。



　　由于無法測定菌體中的溶氧濃度，則無法提供每一時期精確的通氣量，在食用茵的發酵生產中，采取了前期通氣量小，中期通氣量大，后期通氣量小的方式，小通氣量，一般為0.5V/Vmin，大通氣量一般為1.5V/Vmin。



　　（3）攪拌速度的控制



　　通過攪拌，能把從空氣分布管中引入的空氣力成氣泡，增加氣—液的接觸面積，從而增加氧的傳遞還可使液體形成渦流，延長氣泡在液體中的停留時間，增加液體的湍動程度，降低氣泡周圍的液膜E力，增大氧的傳遞系數，此外，還可減少菌絲結團現象，改善細胞對氧的吸收。



　　據報道，在食用菌液體深層培養中，采用通氣攪拌的方式比機械攪拌好；采用間歇攪拌方式比連續攪拌效果更好。



　　攪拌速度大，溶解氧就多，但過大的攪拌速度，對菌體的破壞會很厲害。顯然，對某些菌種，由于攪拌帶來的破壞作用將超過因镕氧增加帶來的促進生長作用，因此不攪拌反而更好。攪拌速度的快慢，因菌株不同而異。如果靈芝菌的深層培養，攪拌不僅影響菌絲的形態，還影響靈芝多糖的產生。隨著攪拌速度的提高，靈芝胞外多糖的產量增加，而胞內多糖的產量下降。



　　（4）pH值的控制



　　當了解到菌株在發酵各時期的合適pH值后，就應想辦法滿足其對酸堿度的要求。首先可以考慮在培養基配方中加入某物質以維持pH值的恒定。此外，還可以通過補料的方式來調節pH值。



　　（5）泡沫的控制



　　泡沫是深層發酵的最大障礙，它不僅造成大量跑液，浪費原料，還增加污染機會。消除泡沫的方法有機械消沫及加消沫劑兩種方法。



　　機械消沫法是在攪拌軸上方安裝消沫器，形式多樣，但效率都不高，特別是對粘性液態泡沫幾乎不起作用。消沫劑有天然油脂類：高碳醇、脂肪酸和酯類；聚醚類；硅酮類等四大類。



　　生產上并非一見泡沫就用消泡劑，有時通過減少通氣量，停止攪拌等方式亦能控制泡沫，改變培養基的成分，亦是減少泡沫的較佳辦法。總之，應摸清產生泡沫的原因，有針對性地采取最佳消沫方式，盡可能少用消沫油或消沫劑。



　　五、發酵終點的判斷



　　在以菌絲為目的物的發酵生產中，將以菌絲體的得串為控制指標，發酵終點的判斷以菌絲形態、數量以及養分的消耗和代謝的變化作為指標。



　　1、  形態觀



　　(1)菌絲鏡檢  在深層培養的早期和中期，菌絲粗狀，分枝較少，著色深，有鎖狀聯合。而后期菌絲變細，并有大量分枝產生，色淺，出現較多空泡，少量存在鎖狀聯合，這是菌絲衰老的象征，應在此之前放罐。



　　(2)菌球觀察  菌絲疏松或緊密地集合在一起，或網狀，肉眼觀察即為菌球。菌球已經中空，表明菌球中部菌絲已老化，部分菌絲自溶，菌球變得光滑，菌球的額色由淺變深，也是老化的象征。



　　(3)菌絲含量測定  選擇菌絲含量不再增加前的某一時刻放罐，是一個比較容易掌握的控制指標。



　　在實際生產及試驗中一般以菌絲含量達到某一定值為指標，再結合菌絲及菌球的觀察結果為參考指標，判斷是否到發酵終點。



　　2、  食用菌深層培養中代謝變化



　　在發酵過程中pH值、氨基氮、糖及其他有效成分含量都隨菌齡的變化而變化，根據上述數據的變化，制作一條代謝曲線，此曲線對指導發酵生產的進行，確定發酵終點有重要作用。但對于以次生代謝產物為目的產物的深層發酵時，一般都在目的產物達到最大值時才終止發酵