2023年12 月 28 日，來自中科院天津工業生物技術研究所的李德茂團隊發表最新研究。該團隊通過阻斷副產物合成、以及優化發酵條件等方法，基于Fusarium venenatum鐮刀菌開發出了低排放、高產率的真菌蛋白生產方法。
結果表明，與野生型菌株相比，經過工程化改造的菌株其菌蛋白合成率提高 57%，碳轉化率提高 62%，蛋白質含量提高 57%，同時二氧化碳排放量顯著降低。
相關論文Efficient Mycoprotein Production with Low CO?Emissions through Metabolic Engineering and Fermentation Optimization of Fusarium venenatum已在線發表于Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊。
（來源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
Fusarium venenatum（以下簡稱 “F. venenatum”）產生的真菌蛋白是一類優質的動物/植物源蛋白質替代品。其中，由F. venenatumA3/5 菌株所產的真菌蛋白 Quorn 已經完成產業轉化，在全球范圍內進入市場銷售。然而，基于該方法的菌蛋白產量較低，因此近年以來，眾多研究者圍繞著F. venenatum的工程化改造以及發酵工程開展優化工作。
糖酵解（glycolysis）是指細胞在無氧條件下，葡萄糖在細胞質中被分解成為丙酮酸的過程。作為該過程的最終產物，丙酮酸又在細胞整個代謝過程中發揮著舉足輕重的作用。
一些早期研究已經證實，改變真菌中丙酮酸的代謝途徑可以顯著提高目標化學品的產量。而在實際研究過程中，研究者還在F. venenatum的發酵過程中發現大量的副產物乙醇?？紤]到乙醇是丙酮酸代謝途徑中的下游產物，那么在此之前，其代謝途徑中還包括利用丙酮酸脫羧酶將丙酮酸催化成為二氧化碳和乙醛。
該過程中，排放出的二氧化碳無疑是限制碳轉化的重要因素之一。因此，研究者試圖通過編輯丙酮酸脫羧酶基因從而阻斷后續代謝通路，其不僅能夠顯著提高真菌蛋白合成的碳轉化率，同時還有利于減少碳排放。
（來源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
為了驗證上述策略的可行性，研究團隊基于 CRISPR/Cas9 工具針對 F. venenatum 基因組中丙酮酸脫羧酶基因 FvPDC6 等進行修改，從而獲得工程化菌株 ΔFvPDC6。
結果如研究者所料，在 1L 搖瓶中發酵 96 小時后，菌株 ΔFvPDC6 中沒有檢測到乙醇產生，而野生型中的乙醇產量達到 5.80g/L。通過進一步分析發現，發酵 96 小時后 ΔFvPDC6 的生物量產量已達到 6.23g/L，葡萄糖消耗僅為 18.5g/L。與之相比，野生型菌株的產量為 6.11g/L，但是葡萄糖消耗量已達到 31.0g/L。這些數據證實，FvPDC6 是主要的丙酮酸脫羧酶基因，并且其可以作為提升真菌蛋白合成效率的突破點之一。
值得注意的是，研究者發現經過不同的發酵時間之后，ΔFvPDC6 與野生型菌株之間的蛋白質增量數據與時間不成比例。這就說明在修改 FvPDC6 之后，還有其他未知因素影響了工程化菌株的蛋白質產量。
為此，研究者進一步對野生型和 ΔFvPDC6 菌株進行了轉錄組學和代謝組學分析。分析結果顯示，FvPDC6 基因修飾后導致有機酸水平顯著上調，其中包括乙酰丙酸、辛二酸、丙酮酸等。然而與乙醇不同的是，這些富集的有機酸仍然以非常低的水平存在。
除此之外，富集的丙酮酸又增強了糖異生途徑，因此，研究者考慮通過過表達丙酮酸羧化酶基因 FvPYC 和刪除磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因 FvPCK 的方法來阻斷糖異生途徑，從而補充草酰乙酸鹽并固定二氧化碳。由此，獲得了菌株 ΔFvPPOEP。
▲圖丨糖異生途徑的轉錄組學和代謝組學分析（來源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
在綜合考慮碳轉化率與蛋白質產量增加數據之后，研究者認為在 5L 的反應器中進行 48 小時發酵是最佳選擇。因此在該條件下，經過上述改造的工程化菌株 ΔFvPPOEP 的菌蛋白合成率、碳轉化率和蛋白質含量與野生型菌株相比分別提高了 16%、73% 和 25%。
在此之后，研究團隊嘗試向生物反應器中添加 ZnSO4以提高菌蛋白合成速率，最終確定其添加量為 20mg/L。
總體而言，經過發酵工藝優化之后，工程化菌株 ΔFvPPOEP 的菌蛋白合成率、碳轉化率和蛋白質含量與野生型菌株相比分別提高了 57%（0.212 vs 0.135g/L·h）、62%（0.351 vs 0.217g/g）和 57%（61.9 vs 39.4%）。
上述數據表明，在相同蛋白產量的情況下，經工程化改造的F. venenatum菌株在發酵過程中葡萄糖消耗可有效減少 61%，并且發酵周期縮短一半以上，這極大地促進了基于F. venenatum的菌蛋白生產效率。不僅如此，考慮到鋅在人類營養和健康中的重要作用，該發酵方法或將在未來為可食用富鋅菌蛋白的合成提供方向。（來源：生輝SciPhi）
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